عنوان آزمايش: خون از چه سلول هايي تشكيل شده است.

هدف آزمايش: چگونگي تهيه گسترش خوني ومشاهده انواع سلول هاي خوني

وسايل آزمايش:

1.لام

2. لانست

3.پنبه والكل

4.رنگ گيمسا ورايت

5. ميكروسكوپ

شرح آزمايش:

هدف ازتهيه گسترش خوني عبارت است از:

الف. شمارش افتراقي گلبول هاي سفيد(DIFF)

ب. بررسي مرفولوژي سلول هاي خوني

جهت مشاهده سلول هاي  خوني در زیر میکروسکوپ باید مراحل زير طي شود:

-I خون گیری از شخص

 II -تهیه گسترش خونی

 III-ثابت کردن خون رو ي لام (گسترش خونی)

IIII - رنگ آمیز ي گسترش خونی

I- مراحل خون گیری:

1-كف دست چپ رابه سمت بالا نگه داشته وبا استفاده از يك تكه پنبه تميز آغشته به الكل اتيليك 70-75 درجه نوك انگشت سوم يا چهارم (ازسمت شست)را ضد عفوني مي كنيم در اطفال مي توانيم از پاشنه پا يا از انگشست شست جهت نمونه گيري استفاده نماييم .
2- با استفاده از يك لانست استريل وبا يك حركت سريع رفت وبرگشت سوراخي در قسمت كناري تاج انگشت ايجاد مي كنيم .
3- به آرامي نوك انگشت را فشار مي دهيم واولين قطره خوني را كه خارج مي شود با استفاده از يك تكه پنبه خشك پاك مي كنيم ( اولين قطره حاوي آب ميان بافتي بوده ورقيق مي باشد در ضمن ممكن است اضافي الكل برسطح پوست باقي مانده باشد كه اين امر خود باعث فيكس شدن مي شود(مخصوصا گسترش ضخيم ).

4- قطره خون درشت را روی لام و در نزدیکی انتهای آن قرار دهید (روی محل بریده شده انگشتتان پنبه آغشته به الکل بگذارید و نگه دارید تا خونریزی قطع شود).
II - تهیه گسترش خونی :

1- با استفاده از يك لام ديگر ، بازاويه حدود 30تا45 درجه ابتدا به سمت عقب حركت تا لام با قطره خون تماس پيدا كرده وخون در عرض آن پخش شود وبعد از اينكه لام باخون تماس پيدا كردبا يك سرعت مناسب (با يک فشارملايم و با  سرعت يکنواخت) لام گسترش دهنده را روبه جلوحركت مي دهيم (توجه داشته باشيد اگر زاويه بزرگ باشد گسترش كوتاه واگر زاويه كوچك باشد گسترش بزرگ ، اگر حركت سريع باشد گسترش كوتاه و اگر حركت كند با گسترش بزرگ خواهد شد ).

2- لام مورد نظر را در حرارت آزمایشگاه قرار دهید تا خوب خشک شود. این خشک شدن باعث تثبیت لایه خون می شود.

نكته مهم: دونوع گسترش خون داريم:گسترش نارك وگسترش ضخيم

لام به صورت فرضي سه قسمت در نظر مي گيريم ودر 3/1 انتهاي لام يك قطره در شت خون ودر 3/1 مياني يك قطره كوچك خون قرار مي دهيم.به دليل اينكه ممكن است قطره كوچك خشك شود ابتدا گسترش نازك را تهيه مي كنيم بدين ترتيب كه با استفاده از يك لام ديگر ، بازاويه حدود 30تا45 درجه ابتدا به سمت عقب حركت تا لام با قطره خون تماس پيدا كرده وخون در عرض آن پخش شود وبعد از اينكه لام باخون تماس پيدا كردبا يك سرعت مناسب لام گسترش دهنده را روبه جلوحركت مي دهيم

جهت تهيه گسترش ضخيم با استفاده از گوشه لام پخش كننده خون به شكل دايره يا مستطيل در حدود 5/1تا 2 سانتيمتر پخش مي كنيم و حركت چرخش را حدود 30 ثانيه ادامه مي دهيم تا از تشكيل رشته هاي فيبرين جلوگيري شود .(اين روش در آزمايشگاه ها جهت شناسايي مالاريا وغيره كاربرد دارد)

ویژگیهای یک گسترش خونی:

1-گسترش خونی دوسوم سطح لام را اشغال کند.گسترش خونی کوتاه ارزش پائینی دارد

2-گسترش خونی ازابتدا وانتهای لام فاصله داشته باشد.

3- گسترش خونی مطلوب دارای مناطق ضخیم متوسط ونازک می باشد.

 4- انتهای گسترش خونی شعله شمعی باشد.

 انتهای گسترش های خونی ناصاف کج ونوک تیز  بی ارزش تلقی میشود.

5-یک گسترش خونی خوب دارای دو حاشیه دردوسمت لام دارد

تهیه یک گسترش خونی استاندار واصولی نخستین قدم درتشخیص سلولهای خونی طبیعی از غیر طبیعی وحکم درخصوص آنهاست.

یک گسترش خونی نادرست باعث اشکال در تشخیص سلول های خونی می شود.لذا بایدلام ها را تمیز و عاری ازچربی انتخاب کرد.

توجه : ميتوان اسلاید آماده شده را در اين مرحله در زیر میکروسکوپ قرار داد. ابتدا با درشت نمایی 100 برابر و پس از آن با درشت نمایی 400 برابر مشاهده کنید.

آیا می توانید گلبول های قرمز خون را تشخیص دهید؟ بله

آیا گلبول های سفید هم دیده می شوند؟ خیر. براي مشاهده گلبول هاي سفيد مراحل زير بايستي انجام شود

III- ثابت کردن خون رو ي لام (گسترش خونی):

روي سطح لام خوني  قطره قطره الکل متانول مي ريزيم . بطوري که الکل تمام سطح لام خوني را فرا بگيرد . صبر مي کنيم (3 تا5 دقیقه). اين لام براي رنگ آميزي آماده است.
IIII - رنگ آمیز ي گسترش خونی

1- روي واقعي لام خوني را مشخص کرده و علامت مي زنيم ( همان طرف لام که قبلا رويش خون کشيده ايم و با الکل متانول آن را ثابت کرده ايم.)

2- لام رادر سطح صاف و تمیزی قرارمي دهيم . سپس با چکاندن آب بر روی لام اثرات الکل را بزدائید. پس از خشک شدن سطح لام چند قطره محلول گیمسای رقیق (cc۱رنگ + cc ۹ آب) را روی آن بریزید. و 20 تا 30 دقیقه صبر کنید. پس از این مدت لام را بطور مایل در دست گرفته و توسط پیست آنقدر آب بر مقطر روی آن بریزید تا تمام اثرات اضافی رنگ زایل شود. لام به رنگ آبي متمايل به بنفش مي شود.پس از خشک شدن لام، اسلاید را زیر میکروسکوپ قرار دهید و با درشت نمایی های مختلف به بررسی سلول های سفید و قرمز خون بپردازید.

مشخصات انواع گلبول های سفید:

1-نوتروفيل ها (پلي مورف نوکلئوئرها): کروي شکل اند , قطر آن ها15-10 ميکرون است, هسته آن ها چند قسمتي (لبوله ) که تکه هاي هسته به وسيله رشته هاي نازک کرماتين بهم اتصال دارند.تعداد لب هاي هسته درحالت نرمال( 5-2)عدد است.

2-  لنفوسيت ها:قطري حدود 12-8 ميکرون دارند .هسته آنها گرد ويک پارچه, پر رنگ با کروماتين فشرده ومتراکم ,هسته حدود 90 درصد سيتوپلاسم سلول را پر کرده است.

3- منوسيت ها : بزرگترين سلول درجريان خون انسان محسوب مي شوند.هسته منوسيت لوبيائي , کليه اي يا به شکل مغز است .کروماتين هسته سلول ظريف , کم رنگ است .سيتوپلاسم اين سلول زياد وآبي روشن است.داخل سيتوپلاسم دانه هاي ريز فلفلي ديده مي شود . گاهي داخل سيتوپلاسم منوسيت واکوئل مشاهده مي شود.

4-ائوزينوفيل ها:اين سلول ها داراي هسته لوبوله هستند , تعداد لوب هاي هسته معمولا دو عدد است, مشخصه اين سلول وجود دانه هاي اختصاصي درشت و فراوان در داخل سيتوپلاسم سلول است.  رنگ اين دانه ها نارنجي است  , دانه ها روي هسته سلول را نمي پوشانند.

5-بازوفيل ها : يک هسته کم رنگ چند قسمتي  دارند .ويژگي مهم اين سلول ها وجود دانه هاي نسبتا زياد سياه رنگ  در داخل سيتوپلاسم سلول که اين دانه هاحتي روي هسته سلول را پوشانده اند .بطوري که هسته سلول به سختي ديده مي شود.

یادآوری:

بهترين رنگ براي رنگ آميزي گسترش خوني  رنگ رايت+ گيمسا است

1 – رنگ رایت : که در ترکیب خود ماده ثابت کننده دارد به گونه ای که ثابت کردن ورنگ آمیزی همزمان صورت می گیرد بنابراین لازم است گسترش ضخیم را قبل از رنگ آمیزی با استفاده از آب مقطر لیز نمائیم .

رنگ رايت ( wrigth-stian):
اين رنگ داراي رنگينه هاي اسيدي مثل ائوزين و رنگينه هاي بازي يا قليائي مثل متيلن بلو (آبي متيلن) ميبا شد.
اساس رنگ آميزي:
اجزا و ساختمان هاي اسيدي سلول ها رنگ هاي قليائي را مي پذيرند لذا اين ساختمان ها را بازوفيليک(قليا دوست) دوستار مواد بازي گويند,مثل هسته سلول که در اين رنگ آميزي آبي رنگ مي شود.  اجزا وساختمان هائي که فقط رنگينه هاي اسيدي را بخود راه مي دهند اسيدوفيليک (اسيد دوست)يا ائوزينوفيليک(ائوزين دوست) مي نامند.اين اجزا که در سيتو پلاسم بعضي سلول ها قرار دارند  با اين رنگ آميزي قرمز رنگ مي شوند اجزاوساختمان هائي که ترکيبي ازدو رنگينه هم رنگينه اسيدي هم رنگينه بازي را به خود راه مي دهند نوتروفيليک(خنثي دوست ) مي نامند .

2 – رنگ گیمسا : در ترکیب این رنگ ماده ثابت کننده وجود ندارد ولازم است قبل از رنگ آمیزی گسترش

نازک را با استفاده از الکل متیلیک مطلق ثابت نمائیم .

گسترش خون	گسترش خون	گسترش خون	گسترش خون
گسترش خون	ائوزينوفيل	مونوسيت	جسم بار
نوتروفیل	ائوزینوفیل	بازوفیل	مونوسیت
لنفوسیت	پلاکت ها	سلول های خونی	سلول های خونی