مقدمات رنگ آمیزی

در این قسمت فقط درباره ی مراحل مقدماتی تهیه یک گسترش باکتریایی، قبل از شروع هر نوع رنگ آمیزی صحبت خواهیم نمود سپس در مورد نحوه ی رنگ آمیزی گسترش بحث خواهیم کرد. چون باکتری ها موجودات بسیار کوچکی هستند در تهیه گسترش باید دقت نمود تا لام های مورد استفاده خراش نداشته باشند و باید تمیز باشند. چرا که هنگام استفاده از لام های خراش دار یا کثیف، خراش ها و ذرات گرد و غبار می توانند با میکروارگانیسم ها اشتباه شوند. همچنین هنگام کا با لامی که تمیز نیست گسترش بخوبی پخش نمی شود. در صورتی که لام کثیف بود جهت تمیز کردن آن به روش زیر عمل نمایید:

1. در کنار دستشویی آزمایشگاه باید ظرف حاوی پودر یا مایع پاک کننده قرار دهید.

2. شیر آب گرم را باز نموده و دو انگشت سبابه و میانی خود را خیس نموده به صابون یا پودر پاک کننده آغشته نمایید.

3. هر دو روی لام را با مالیدن انگشتان آغشته به ماده ی پاک کننده تمیز کنید.

4. لام را با آب گرم بشویید.

5. در لام های بسیار کثیف مراحل 3 و 4 را چند بار تکرار نمایید.

6- چند قطره الکل روی لام بریزید و قبل از خشک شدن الکل، به کمک دستمال کاغذی تمیز آن را پاک نمایید.

اکنون لام جهت رنگ آمیزی باکتری ها آماده است. لذا مراحل زیر را برای قرار دادن و چسبانیدن باکتری ها روی لام جهت رنگ آمیزی انجام می دهیم:

1- تهیه گسترش

لامی که برای این منظور بکار می گیرید باید خشک، تمیز و عاری از چربی باشد. برای تهیه ی گسترش از محیط کشت مایع با حلقه ی فیلدوپلاتین یا پی پت پاستور یا سوآب، کمی از مایع مورد آزمایش را برداشته در وسط لام قرار دهید سپس آن را همچون ورقه نازکی روی لام گسترش دهید. هنگامی که از محیط کشت جامد گسترش تهیه می نمایید ابتدا باید یک قطره سرم فیزیولوژی را روی لام قرار دهید سپس با فیل دوپلاتین مقداری از پرگنه را برداشت نموده و در قطره ی روی لام حل کنید تا شیررابه ی یکنواختی تهیه بعد آن را در وسط لام پخش نمایید.

برای تهیه گسترش باید مقدار مناسبی از باکتری را روی لام قرار داد چرا که اگر گسترش خیلی ضخیم باشد به معنی آن است که مقدار زیادی از باکتری روی لام قرار گرفته و می تواند مانع عبور نور شود. همچنین در گسترش ضخیم باکتری ها اغلب روی همدیگر قرار دارند و مشاهده ی تک تک آنها مشکل است. گسترش ضخیم به طور معمول توسط مبتدیان و از کشت های جامد تهیه می گردد.

نقطه مقابل این مشکل تهیه ی گسترش خیلی نازک است یعنی تعداد بسیار کمی باکتری روی لام قرار می گیرد و در نتیجه پیدا کردن آنها با میکروسکوپ مشکل است. اینگونه گسترش ها بیشتر از محیط کشت های مایع تهیه می گردند. بنابراین گسترشی مطلوب و مناسب است که نه ضخیم و نه خیلی نازک باشد.

2- خشک کردن

چون بر اثر رنگ آمیزی و شستشوی مکرر ممکن است میکروب ها از روی لام کنده شوند لازم است گسترش را ثابت نمایید. یعنی به طریقی میکروب ها را کشته و روی لام بچسبانید. ثابت کردن را می توان به روش های مختلف انجام داد (مانند حرارت، الکل و...) ساده ترین روش حرارت دادن است. بدین منظور لام را تا پنج بار به طور آهسته از روی شعله چراغ عبور دهید باید دقت نمایید تا حرارت زیاد نباشد چون ممکن است میکروب ها سوخته و غیر قابل تشخیص گردند. اگر حرارت کم باشد ممکن است میکروب ها ثابت نشوند. برای در نظر گرفتن حرارت مناسب که در حدود 70 درجه است لام را با پشت دست امتحان کنید نباید سوزاننده باشد.

اگر بخواهید با الکل گسترش را ثابت کنید باید روی گسترش الکل ریخته و اضافه آن را خالی نمایید و صبر کنید تا بقایای الکل تبخیر شود. این عمل لا استفاده از شعله ور ساخت الکل نیز این عمل امکان پذیر است، در این روش روی گسترش چند قطره الکل ریخته و اضافه ی آن را خالی نمایید. لام را روی شعله بگیرید اما قبل از اینکه شعله الکل خاموش شود برای جلوگیری از تغییر شکل باکتری ها، شعله را خاموش نمایید. به طور کلی ثابت کردن باعث انعقاد پروتئین های باکتری ها و سلول ها می گردد و در اثر آن میکروب ها روی لام چسبیده و با شستن پاک نمی شوند.