رنگ آمیزی کپسول

برخی از باکتری ها ماده لزجی ترشح می کنند که در خارج آن متمرکز شده و دیواره باکتری را می پوشاند. کپسول ساختمان متراکم و مشخصی دارد که با رنگ آمیزی می توان آن را مشاهده نمود. هنگامی که پلیمر خارج سلولی به صورت متراکم و دارای حدود واضح و مشخص باشد آن را کپسول می نامند و در مواقعی که ماده مذکور متراکم نبوده و به صورت الیاف در هم و تا حدودی گسسته از فیبریل های خارج سلولی تشکیل شده باشد گلیکوکالیکس نامیده می شود. در برخی باکتری ها مقادیر زیادی از ماده مذکور ساخته می شود که ظاهراً از سلول جدا می شود و به نظر می رسد که باکتری در این مواد فرو رفته که در این حالت چنین موادی را قشر لعابی (لایه ی سست) می نامند.

جنس کپسول در اکثر موارد از پلی ساکارید است و تنها مورد استثناء، مربوط به باسیلوس آنتراسیس (عامل سیاه زخم) اس که دارای کپسول پلی پپتیدی (پلمیر اسید کلوتامیک راستبر) است. باسیلوس مگاتریوم دارای کپسولی از پلی ساکارید و پلی پپتید است همچنین جنس کپسول استرپتوکوکوس گروه C و A سفید از اسید هیالورونیک و کپسول لکونوستک مزانتروئیدی از دکستران (پلیمر گلوکز) است. کپسول در شرایط نامساعد از خشک شدن اجرام جلوگیری می نماید و از طرفی به عنوان لایه ی محافظ عمل کرده و باکتری ها را در برابر عمل بیگانه خواری گلبول های سفید در امان می دارد (تا زمانی که آنتی بادی علیه کپسول ترشح نشده است). گلیکوکالیکس نقش مهمی در امر اتصال و چسبیدن باکتری ها به سطح سلول های میزبان دارد به عنوان مثال در استرپتوکوکوس موتانس، گلیکوکالیکس که جنس آن از دگستران و لوان (پلیمر فوکوز) است. عامل اصلی چسبندگی باکتری به مینای دندان ها است.

الف) روش آزمایش (استفاده از دندانه)

1. ابتدا گسترشی از باکتری کپسولدار تهیه نمایید.

2. صبر کنید تا گسترش در حرارت آزمایشگاه خشک شود.

3. از محلول فوشین غلیظ روی گسترش اضافه نمایید و به مدت یک دقیقه به ملایمت حرارت دهید.

4. ابتدا با الکل و سپس با آب شستشو دهید.

5. محلول دندانه را روی گسترش بریزید و به مدت 30 تا 60 ثانیه صبر کنید.

6. با الکل شستشو دهید تا زمانی که قطرات الکل بی رنگ یا کم رنگ شود.

7. لام را با آب شستشو دهید.

8. با آبی متیلن به مدت 30 تا 60 ثانیه گسترش را بپوشانید.

9. لام را شسته و به صورت مورب قرار دهید تا خشک شود.

10. با عدسی 100 و روغن ایمرسیون مشاهده نمایید و مشاهدات خود را در گزارش کارتان ترسیم نمایید.

* جسم باکتری به رنگ قرمز و کپسول به رنگ آبی در می آید.

* ترکیب محلول دندانه:

- 20 کیلی لیتر از محلول 7 درصد کلرور نقره

- 50 میلی لیتر از محلول 12 درصد پتاسیم آکوم

- 20 میلی لیتر از محلول 20 درصد اسید تانیک

ب) روش آزمایش (روش ولچ)

1. ابتدا از باکتری کپسولدار گسترش تهیه نمایید.

2. پس از خشک شدن به مدت 7 تا 10 دقیقه با کریستال ویوله رنگ آمیزی نمایید.

3. با سولفات مس 20٪ شستشو دهید.

4-. پس از خشک شدن با عدسی 100 و روغن میکروسکوپ مشاهده کنید.

5. مشاهدات خود را در گزارش کارتان ترسیم نمایید.

* جسم باکتری به رنگ آبی پر رنگ و کپسول باکتری، آبی کم رنگ مشاهده می شود.

* وجود کپسول باکتری ها را می توان با رنگ آمیزی منفی (نگروزین، مرکب چین)، مشاهده و اثبات کرد.

ج) روش آزمایش (روش چرچمن)

1. یک قطره از محلول رنگی رایت را روی لام قرار دهید.

2. با استفاده از فیلدوپلاتین مقداری از باکتری کپسولدار را برداشت نموده در قطره رنگ حل نمایید و گسترش تهیه کنید.

3. صبر کنید تا گسترش خشک شود.

4. لام را به آرامی شستشو دهید و صبر کنید تا در حرارت آزمایشگاه خشک شود.

5. در زیر میکروسکوپ با عدسی 100 و روغن ایمرسیون مشاهده کنید و مشاهدات خود را ترسیم نمایید.

* در این روش کپسول به رنگ صورتی و باکتری آبی رنگ دیده می شود.

* محلول رنگی رایت برای رنگ آمیزی خون به کار می رود (1/0 گرم ماده ی رنگی رایت در 60 میلی لیتر الکل متیلیک خالص)

منبع:کتاب آزمایشگاه میکروبشناسی بابک براتی

رنگ آمیزی اسید - فست

پل ارلیش رنگ آمیزی اسید – فست را در سال 1882، به هنگام بررسی عامل بیماری سل (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس) ابداع کرد. برخی از باکتری ها وقتی با کربول فوشین غلیظ همراه با حرارت رنگ آمیزی شوند و بعد برای رنگ بری در تأثیر اسیدهای قوی قرار گیرند رنگ خود را از دست نمی دهند و در برابر اسیدها مقاومند (اسید – فست هستند). این پدیده اساس رنگ آمیزی اسید – فاست است که برای رنگ آمیزی باکتری های خانواده مایکوباکتریوم ها از جمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بکار می رود. در این روش ابتدا گسترش را تحت تأثیر کربول فوشین غلیظ و حرارت قرار می دهند سپس با اسید رنگ بری را انجام می دهند و پس از شستشو، لام را آبی متیلن رنگ آمیزی می نمایند. در این صورت کلیه باکتری ها به رنگ آبی در می آیند. به استثناء مایکوباکتریوم ها که اسید – فست بوده و رنگ قرمز مربوط به کربول فوشین را حفظ می کند. مقاومت در برابر در باکتری ها مربوط به وجود مواد چربی و موم موجود در دیواره است.

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس نه تنها در مقابل است بلکه در مقابل الکل هم، مقاوم است. زمانی که در نمونه های آزمایشگی (خلط و ادرار) رنگ آمیزی را انجام می دهیم باید لام ها را با اسید و الکل رنگ بری کنیم چرا که با این مایکوباکتریوم های ساپروفیت (همچون مایکوباکتریوم سمگماتیس) که در مقابل الکل مقاوم نیستند باعث اشتباه نشوند.

روش آزمایش (ذیل نلسون)

1. با رعایت شرایط سترون، گسترشی مخلوط ار کایکوباکتریوم اسمگماتیس و استافیلوکوس اپیدرمیدیس تهیه نموده، پس از خشک شدن با حرارت آن را ثابت نمایید.

2. گسترش را با کربول فوشین بپوشانید و به مدت 5 دقیقه روی حمام آب جوش،حرارت دهید.

3. ابتدا رنگ را از روی لام دور ریخته با آب شستشو دهید و با اسید سولفوریک 5 درصد رنگ بری نمایید.

4. لام را با آب شسته و با آبی متیلن به مدت 30 ثانیه گسترش را بپوشانید.

5. لام را دوباره با آب بشویید.

6. لام را به آرامی و به دقت با کاغذ خشک کن خشک کنید و یا به صورت مورب قرار داده و صبر کنید تا خشک شود.

7. با عدسی 100 میکروسکوپ و روغن ایمرسیون مشاهده نمایید.

* باکتری های اسید – فست قرمز رنگ و سایر باتری ها به رنگ آبی مشاهده می شوند.

* این رنگ آمیزی برای شناسایی و بررسی بیماری هایی که توسط باکتری های اسید – فست همچون بیماری سل (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس) و بیماری جذام (مایکوباکتریوم لپره) ایجاد می شوند، مورد اتژستفاده قرار م گیرند.

* برخی از گونه های جنس نوکاردیا اسید – فست نسبی هستند.

* اسپور باکتری ها در رنگ آمیزی اسید – فست به رنگ قرمز مشاهده می شود.

ادامه از پست قبلی

الف) روش آزمایش (روش شافر – فولتون)

1. از باسیلوس سوبیتیلیس گسترش تهیه نمایید و پس از خشک شدن با حرارت ثابت کنید.

2. گسترش را با سبز مالاشیت بپوشانید و به مدت 5 دقیقه روی حرارت حمام آب جوش قرار دهید.

3. مراقب باشید تا رنگ نجوشد و خشک نشود. برای جلوگیری از خشک شدن می توانید دوباره مقداری از سبز مالاشیت را روی لام اضافه نمایید.

4. رنگ را از روی لام خالی نمایید و با آب آن را بشویید.

5. با سافرانین به مدت 20 تا 30 ثانیه گسترش را بپوشانید.

6. رنگ را خالی نموده و با آب لام را بشویید.

7. با کاغذ خشک کن لام را خشک نمایید و با روغن ایمرسیون و عدسی 100 میکروسکوپ مشاهده کنید.

ب) روش آزمایش (روش دونر)

1. پنج قطره آب مقطر سترون را درون لوله ی آزمایش بریزید و با کمک فیلدوپلاتین پرگنه باسیلوس سوبتیلیس را به درون لوله انتقال داده و سوسپانسیون غلیظی از آن تهیه نمایید.

2. پنج قطره از کربول فوشین را به سوسپانسیون داخل لوله اضافه نمایید.

3. لوله ی آزمایش را به مدت 10 دقیقه درون آب جوش قرار دهید.

4. قطره کوچکی از نگروزین را روی لام قرار داده و چند لوپ از سوسپانسیون فوق را در آن حل نمایید.

5. با استفاده از انتهای یک لام قطره مذکور را روی لام پخش کنید.

6. صبر کنید تا گسترش به دست آمده در حرارت آزمایشگاه خشک شود.

7. زیر میکروسکوپ با عدسی 100 مشاهده نموده و مشاهدات خود را در گزارش کارتان ترسیم کنید.

* در این روش زمینه ی لام سیاه رنگ، اسپور قرمز رنگ و باکتری بی رنگ است.

ج) روش آزمایش

1. ار بسیلوس سوبتیلیس گسترش تهیه نموده و پس از خشک شدن، آن را با حرارت ثابت کنید.

2. با کربول فوشین گسترش را بپوشانید را بپوشانید و به مدت 5 دقیقه با شعله ی گاز حرارت دهید. دقت نمایید تا رنگ نجوشد و خشک نشود.

3. لام را با آب بشویید.

4. با آبی متیلن به مدت 30 ثانیه گسترش را رنگ آمیزی نمایید.

5. لام را با آب بشویید و پس از خشک شدن با عدسی 100 میکروسکوپ مشاهده کنید.

* اسپور به رنگ قرمز و باکتری به رنگ آبی مشاهده می شود.

رنگ آمیزی اسپور

برخی از باکتری ها دارای قدرت ایجاد اسپور هستند یا اندواسیور مرحله ی استراحت مقاوم در باکتری ها است. اسپورها قادرند در شرایط نامساعد که باکتری ها قادر به تحمل آن نیستند، مانند: حرارت، سرما، خشکی، مواد شیمیایی، تشعشعات و... زنده بمانند. هر باکتری فقط یک اسپور می سازد و از هر اسپور یک باکتری بوجود می آید.

اسپور ممکن است کروی یا بیضی باشد. اندازه ی آن بین 2/0 تا 2 میکرون است. در برخی از موارد قطر اسپور از قطر باکتری بزرگتر است و باعث برجستگی در باکتری می شود. گاهی نیز اسپور برابر یا کوچکتر از باکتری است. اسپور را به علت شفافیت و شکست زیاد نور می توان با میکروسکوپ فازکنتراست مشاهده کرد. اگر باکتری ها را به روش گرم رنگ آمیزی کنید اسپور را به صورت منطقه ای شفاف مشاهده می کنید. از جمله باکتری هایی که دارای اندواسپور هستند می توان جنس هاس کلستریدوم و باسیلوی، اسپوروسارسینا، اسپورولاکتوبا سیلوس، دسولفوتوماکولوک، کوکسیلا بورنتی (ریکتزیای عامل تب کیو) را نام برد.

بوسیله میکروسکوپ الکترونی در مقطع اسپور از داخل به خارج قسمت های زیر مشاهده می شود:

1. کور یا هسته اسپور: از پروتوپلاست تشکیل شده که حاوی یک هسته کامل (کروموزوم) است. آنزیم های تنفسی سیتوکرم در اسپور وجود ندارد و معدودی از آنزیم های سلولی که در شکل رویشی باکتری وجود دارند در اسپور به مقدار زیاد وجود دارند (مانند آلانین – راسماز) اما آنزیم دی پیکولینیک اسید سنتتاز تنها در اسپور وجود دارد. بخشی از توانایی مقاومت اسپور در مقابل حرارت مربوط بحالت نسبتاً خشک و کم آب آن است و دیگر وجود مقادیر بسیار زیادی پیکولینات کلسیم است که در شکل رویشی باکتری وجود ندارد.

2. غشا داخلی: از غشاء سیتوپلاسمی باکتری منشاء می گیرد.

3. دیواره ی اسپور: مانند دیواره باکتری ها است که هنگام جوانه زدن منشاء دیواره سلولی باکتری خواهد بود.

4. کورتکس: جنس آن از نوعی پپتیدوگلیکان است که ضخیم ترین لایه اسپور را تشکیل می دهد.

5. غشاء خارجی: مانند غشاء داخلی است.

6. پوشش اسپور: از ماده پروتئینی شبیه کراتین ساخته شده است.

7. اگزواسپوریم: در برخی از گونه ها وجود دارد. غشاء ظریفی است که از لیپوپروتئین تشکیل شده است.

اسپور را می توان به آسانی رنگ نمود و زمانی را پذیرفت به آسانی نمی توان رنگ زدایی کرد. بدین منظور برای نفوذ رنگ (سبز مالاشیت) به داخل پوشش اسپور از حرارت استفاده می شود. سبز مالاشیت به آسانی از جسم باکتری شسته می شود چرا که دیواره سلولی بر اثر حرارت آسیب دیده و پاره شده است. بدین سان اسپور دارای رنگ سبز مالاشیت و باکتری بدون رنگ است که می توان با رنگ دوم (سافرانین) آن را رنگ آمیزی نمود. در مشاهده ی میکروسکوپی لام رنگ آمیزی شده، اسپورها درون باکتری های سرخ رنگ به صورت منطقه های کروی یا بیضوی کوچک سبز رنگ دیده می شوند. البته اندازه، شکل و محل اسپور در داخل باکتری برای تشخیص ارگانیسم ها اهمیت دارد. برای مثال اسپورها می توانند در مرکز، انتها و یا نزدیک به انتهای باکتری جای داشته باشند.

رنگ آمیزی دیواره ی سلولی

دیواره ی سلولی پروتوپلاست را احاطه کرده و در قسمت خارجی غشاء سیتوپلاسمی قرار دارد با استحکام خود، مانع از پاره شدن غشاء سیتوپلاسمی و متلاشی شدن باکتری در فشارهای اسمزی می شود. فشار اسمزی در باکتری های گرم مثبت و گرم منفی به ترتیب ممکن است به حدود 25 و 10 اتمسفر برسد. دیواره سلولی حدود 15-10 درصد وزن خشک باکتری را تشکیل می دهد. به علت اینکه ساختمان شیمیایی جدار باکتری ها به هیچ یک از ساختمان های بافت های حیوانی شبیه نیستند برخی از آنتی بیوتیک ها همچون باسیتراسین، سفالوسپورین ها، ریستوستین، سیکلوسرین، پنی سیلین و وانکومایسین که بر سنتز دیواره سلولی تأثیر می گذارند باکتری ها را نابود می کنند بدون آنکه به میزبان آسیب برسانند.

در صورتی که باکتری ها در محلول های نمکی هیپرتونیک قرار داده شوند پرتوپلاست چروکیده شده خارج می شود و تنها دیواره سلولی (میان تهی) که شکل باکتری را حفظ نموده باقی می ماند این اثر را پلاسمولیز می نامند که در باکتری های گرم منفی آسانتر اتفاق می افتد. اما باکتری ها در محلول هایپوتونیک در مقابل ورم کردن بیش از حد و ترکیدگی مقاومند و علت آن وجود دیواره سلولی است.

تمامی سلول های پروکاریوتی به استثنای مایکوپلاسماها و باکتری های نمک دوست (هالوفیل) ترکیب دیواره ای مشترکی به نام پپتیدوگلیکان یا مورئین دارند که موجب استحکام و حفظ شکل سلول می شود. برخی از باکتری ها در شرایطی دیواره سلولی خود را از دست داده و باعث بوجود آمدن اشکال L. form باکتری می شوند. دیواره سلولی باکتری های هالوباکتریاسه فاقد پپتیدوگلیکان است، این باکتری ها برای حفظ ساختمان خود به نیروهای الکتروستاتیک وابسته اند و در محلول هایی که غلظت نمکی آنها کم است متلاشی می شوند. مایکوپلاسماها نیز فاقد دیواره سلولی اند همچنین در برخی از باکتری های متانوژنیک و آرکی باکتریاها بجای اسید مورامیک دیواره سلولی، اسید تالوسامینورونیک مشاهده می شود.

دیواره سلولی در سلول های پروکاریوت بسیار پیچیده است. دیواره سلولی جایگاه بسیاری از شاخص های آنتی ژنیک است که باکتری ها را از یکدیگر تمایز می دهند. دیواره سلولی در باکتری های گرم منفی همراه با فعالیت اندوتوکسینی است.

روش آزمایش

1. گسترشی ضخیم از باسیلوس سوبتیلیس تهیه نمایید.

2. صبر کنید تا مقداری از آب گسترش کم شود اما خشک نشود.

3. در حالیکه گسترش هنوز رطوبت دارد و بدون ثابت کردن از محلول اسید فسفومولیبدیک روی گسترش بریزید تا همه جای آن پوشانده شود و به مدت 4 دقیقه آن را نگه دارید.

4. رنگ را از روی لام خالی نمایید.

5. در حالیکه گسترش هنوز رطوبت اسید را از دست نداده به مدت پنج دقیقه آن را با محلول رنگی سبز متیل بپوشانید.

6. به آرامی لام را بشویید به طوری که گسترش آسیب نبیند.

7. صبر کنید تا لام در هوای آزمایشگاه خشک شود.

8. با استفاده از عدسی 100 و روغن ایمرسیون در زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.

9. مشاهدات خود را با توضیحات لازم در گزارش کارتان مرقوم فرمایید.

* دیواره سلولی به رنگ سبز تیره یا آبی و سیتوپلاسم به رنگ سبز روشن است البته گاهی ممکن است سیتوپلاسم اصلاً رنگ نگیرد.

رنگ آمیزی گرم

این نوع رنگ آمیزیاولین بار توسط یک پزشک دانمارکی به نام هانس کریستین گراهام در سال 1884 ابداع گردید و یکی از مهمترین و مفیدترین رنگ آمیزی هایی است که در آزمایشگاه میکروب شناسی مورد استفاده قرار می گیرد چرا که باکتری ها را به دو دسته اصلی گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می کند. این دسته بندی در تشخیص و شناسایی باکتری ها بسیار مفید و کاربردی است. زیر اغلب با خصوصیات عمده دیگر باکتری ها نظیر حساسیت به آنتی بیوتیک ها و غیره همراه است. برخی از این خصوصیات به طور نمونه در ذیل ذکر شده است.

1.  باکتری های گرم مثبت به طور معمول نسبت به پنی سیلین و مواد رنگی ضد باکتریایی (بازدارنده رشد باکتری) حساس تر از باکتری های گرم منفی هستند.

2. باکتری های گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و نیز آنزیم لیزوزیم حساسترند.

3. باکتری های گرم مثبت به طور معمول اگزوتوکسین تولید می کنند، در حالی که گرم منفی ها دارای اندوتوکسن هستند.

4. گرم مثبت بودن خصوصیتی است که به آسانی از بین می رود. در حالیکه گرم منفی بودن هرگز از بین نمی روند.

در این رنگ آمیزی باکتری هایی را که بوسیله حرارت ثابت شده اند به صورت پیاپی با کریستال ویوله و محلول (ید و یدیدپتاسیم) رنگ آمیزی نمود سپس برای رنگ زدایی از الکل و استون استفاده می شود که پس از شستشو با آب با یک رنگ متضاد (سافرانین یا فوشین) رنگ آمیزی می نمایند. باکتری های گرم مثبت رنگ اولیه خود را از دست نمی دهند و در زیر میکروسکوپ به رنگ آبی تیره در می آیند اما باکتری های گرم منفی رنگ اولیه را از دست می دهند و رنگ قرمز سافرانین یا فوشین را به خود می گیرند مرحله مشکل در هنگام رنگ آمیزی گرم، بی رنگ کردن آن ایست. اگر بی رنگ کردن(الکل و استون) بیش از اندازه باشد، باکتری های گرم مثبت، بی رنگ  خواهند شد و به صورت گرم منفی ظاهر می شوند و اگر بی رنگ شدن کافی نباشد، با کتری های گرم منفی، بی رنگ نخواهند شد و گرم مثبت بنظر می رسند. بنابراین، مرحله بی رنگ شدن باید مناسب و دقیق باشد. در ضمن باید باکتری مورد آزمایش جوان(کشت 12 تا 18 ساعته) باشد چرا که بسیاری از با کتری های گرم مثبت در اثر پیری خصوصیت خود را از دست داده و به صورت گرم منفی ظاهر می شوند.

هنوز هیچ توصیف قابل قبول و همگانی در مورد چگونگی واکنش گرم وجود ندارد گر چه نظریه های متعددی ارائه شده است اما هیچ یک از آنها به طور کامل رضایت بخش نیست به هر حال نظریه ای که هم اکنون اعتبار بیشتری دارد مکانیزم رنگ آمیزی گرم را به علت رسوب رنگی کریستال ویوله و لوگل می داند که در غشاء یا دیواره باکتری قرار می گیرد. دیواره سلولی باکتری های گرم منفی دارای لیپید بوده که در اثر شستشو با استون یا الکل حل شده و منافذی در سطح دیواره باکتری ایجاد می کند.الکی و استون از این منافذ عبور کرده و رسوب رنگی ایجاد شده را از بین می برد. از طرف دیگر، دیواره سلول باکتری های گرم مثبت فاقد لیپید بوده و دارای ترکیب ساختمانی خاصی مرکب از موکوپپتید است. در باکتری های گرم مثبت، پلی ساکارید همراه با ماده رنگی و اسید تیکوئیک در ساختمان دیواره ان دیده می شوند.

روش آزمایش

1. آزمایش گسترشی از باکتری مورد نظر تهیه کنید و پس از خشک شدن با حرارت ثابت نمایید.

2. روی لام به اندازه کافی رنگ کریستال ویوله بریزید و بگذارید که رنگ به مدت یک دقیقه روی لام بماند.

3. گوشه ای از لام را که تمیز است بین انگشت نشانه و شست نگهدارید و رنگ را در ظرف رنگ آمیزی خالی کنید و ان را با آب بشوئید.

4. لام را دوباره روی میله ی رنگ آمیزی قرار دهید و روی آن به مقدار کافی لوگل (ید و یدیدپتاسیم) بریزید و بگذارید به مدت یک دقیقه روی لام بماند.

5. محلول لوگل را دور ریخته و عمل شستشو (رنگ بری) را با الکل و استون انجام دهید به طوری که آخرین قطراتی که از لام می ریزد، صورتی کم رنگ یا بی رنگ باشد.

6. لام را بلافاصله با آب بشویید. (برای متوقف شدن عمل رنگ بری)

7. لام را دوباره روی میله ی رنگ آمیزی قرار دهید و آن را با رنگ متضاد سافرانین بپوشانید و به مدت یک دقیقه صبر کنید.

8. رنگ روی لام را خالی کرده با آب شستشو دهید.

9. به آرامی لام رنگ آمیزی شده را روی کاغذ خشک کن قرار دهید ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.

* رنگ آمیزی فوق را برای باکتری های اشریشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، نایسریاسیکا و باسیلوس سوبتیلیس انجام دهید و نتایج را در گزارش کار خود قید نمایید.

* پس از پایان رنگ آمیزی و مشاهده با عدسی 100 میکروسکوپ کدامیک گرم مثبت (آبی یا بنفش) و کدامیک گرم منفی (قرمز رنگ) هستند؟

* تقریباً یک سوم کوکسی ها، نیمی از باسیل ها و تمام اسپیروکت ها گرم منفی هستند.

* برای حفظ نمودن ترتیب مراحل رنگ آمیزی گرم می توانید از کلمه کلاس (ک = کریستال ویوله، ل = لوگل، ا = الکل یا استون، س = سافرانین) استفاده نمایید.

* در صورتی که گسترش را بیش از اندازه حرارت دهید (در عمل ثابت کردن)، دی.اره ی یاخته ها پاره می شود بنابراین باکتری های گرم مثبت رنگ کریستال ویوله را از دست می دهند و رنگ سافرانین را جذب می کنند.

* جهت انجام صحیح آزمایش باید به طول زمان و کامل بودن شستشو بعد از کریستال ویوله و مقدار آب باقیانده روی گسترش به هنگام اضافه نمودن لوگل، دقت نمود.

* برخی مواقع در اثر عدم رعایت زمان های لازم در رنگ آمیزی، ارگانیسم ها رنگ اصلی خود را کسب نکرده باعث اشتباه می شوند. جهت تشخیص باکتری های گرم منفی از گرم مثبت می توانید به روش ذیل نیز عمل کنید:

1- یک قطر پتاس 3 درصد را روی لام قرار دهید.

2- با استفاده از فیلدوپلاتین پرگنه باکتری را در قطره مذکور حل نمایید و به آهستگی فیلدوپلاتین را از محلول خارج سازید.

* اگر مایع چسبنده بود و تا ارتفاع 5/0 – 2 سانتیمتر از سطح لام بلند شد باکتری گرم منفی است در غیر این صورت گرم مثبت است.

* پرگنه باکتری های گرم منفی در مواجهه با سوآب آغشته به L.analine4-intrianilideباعث زرد رنگ شدن سوآب می شوند اما پرگنه باکتری های گرم مثبت این گونه نیست.

رنگ آمیزی ساده

همانطور که ذکر شد در رنگ آمیزی ساده کلیه قسمت های باکتری یکسان رنگ آمیزی می شوند که برای مشاهده ی شکل و اندازه میکروب ها بکار می رود. در این نوع رنگ آمیزی از یک نوع رنگ استفاده می شود و آن هم اغلب از انواع رنگ های قلیایی است که منجر به رنگ شدن باکتری می گردد. رنگ باکتری با توجه به رنگ به کار رفته متفاوت است به طور مثال در صورتی که از رنگ آبی متیلن استفاده شود باکتری به رنگ آبی مشاهده خواهد شد و اگر از رنگ های فوشین و سافرانین استفاده شود باکتری به رنگ قرمز نمایان خواهد شد.

شایان ذکر است که در این نوع رنگ آمیزی، اسپور و دانه های چربی رنگ نخواهند شد و به صورت شفاف مشاهده خواهند شد. این امر به دلیل ساختمان سخت اسپور و ماهیت دانه های چربی است که نحوه ی رنگ آمیزی آنها در آزمایش بعدی توضیح داده خواهد شد.

روش آزمایش:

1. ابتدا به گسترش از باکتری های استافیلوکوکوس، اشرشیاکلی و باسیلوس سوبتیلیس روی سه لام مختلف تهیه نمایید.

2. پس از خشک شدن گسترش ها، آن را با حرارت ثابت نمایید.

3. گسترش ها را با محلول رنگی آبی متیلن به مدت یک دقیقه بپوشانید.

4. با آب شستشو دهید و صبر کنید تا لام خشک شود.

5. با عدسی 100 و روغن ایمرسیون مشاهده کنید.

توجه: در رنگ آمیزی فوق بجای محلول رنگی آبی متیلن می توانید از محلول های دیگری همچون سافرانین یا فوشین نیز استفاده نمایید.

رنگ آمیزی منفی

در این روش، از رنگی ساده که باکتری ها را رنگ ننموده و تن ها زمینه لام را رنگ می کند استفاده می شود. یعنی زیر میکروسکوپ زمینه ی لام رنگی و باکتری ها به صورت اجسامی شفاف در این زمینه، مشاهده می شوند. مزیت این روش نسبت به روش های دیگر این است که، شکل میکروب ها در اثر اضافه شدن رنگ ها تغییر نمی کند ضمن آن را که میکروارگانیسم های مورد مطالعه به اندازه طبیعی خود دیده می شوند. رنگ هایی که خاصیتی این گونه رنگ سیاه هستند و باعث تیره شدن زمینه ی لام می شوند و قرمز کنگو نیز باعث قرمز شدن زمینه می گردد که در اثر افزودن اسید می تواند به رنگ آبی نیز مشاهده شود.

الف- روش آزمایش (نیگروزین)

1. ابتدا قطره ی کوچکی از نگروزین را روی لام تمیز و خشک قرار دهید.

2. با فیلروپلاتین مقدار کمی از پرگنه استافیلوکوکوس را برداشت نموده و در قطره نگروزین حل نموده گسترش تهیه کنید.

3. صبر کنید تا گسترش خشک شود.

4. با عدسی 100 و روغن ایمرسیون مشاهده نموده و در گزارش کار خود ترسیم نمایید.

تذکر 1: آزمایش فوق را با پرگنه با سیلوس سوبتیلیس و کلبسیلا نیز انجام دهید.

تذکر 2: می توانید به جای نگروزین از مرکب چین استفاده نمایید.

تذکر 3: برای بررسی و مشاهده ی جرم های دندان می توانید با استفاده از یک خلال دندان، سطح و شکاف بین دندان ها را تراشیده و از رسوب به دست آمده و نگروزین، گسترش تهیه نمایید.

ب – روش آزمایش (قرمز کنگو یا روژ دو کنگو)

1. ابتدا قطره ای از قرمز کنگو را روی لام تمیز و خشک قرار دهید.

2. با فیلدوپلاتین مقدار کمی از پرگنه های باکتری های فوق را برداشت نموده در قطره ی قرمز کنگو حل نموده گسترش تهیه کنید.

3. صبر کنید تا گسترش خشک شود.

4. روی لام محلول 1٪ اسید کلریدریک در الکل بریزید سپس لام را سرازیر کنید و بدون اینکه لام را شستشو دهید صبر کنید تا لام خشک شود.

5. با عدسی 100 و روغن ایمرسیون مشاهده کنید و مشاهدات خود را در گزارش کارتان ترسیم نمایید.

مقدمات رنگ آمیزی

در این قسمت فقط درباره ی مراحل مقدماتی تهیه یک گسترش باکتریایی، قبل از شروع هر نوع رنگ آمیزی صحبت خواهیم نمود سپس در مورد نحوه ی رنگ آمیزی گسترش بحث خواهیم کرد. چون باکتری ها موجودات بسیار کوچکی هستند در تهیه گسترش باید دقت نمود تا لام های مورد استفاده خراش نداشته باشند و باید تمیز باشند. چرا که هنگام استفاده از لام های خراش دار یا کثیف، خراش ها و ذرات گرد و غبار می توانند با میکروارگانیسم ها اشتباه شوند. همچنین هنگام کا با لامی که تمیز نیست گسترش بخوبی پخش نمی شود. در صورتی که لام کثیف بود جهت تمیز کردن آن به روش زیر عمل نمایید:

1. در کنار دستشویی آزمایشگاه باید ظرف حاوی پودر یا مایع پاک کننده قرار دهید.

2. شیر آب گرم را باز نموده و دو انگشت سبابه و میانی خود را خیس نموده به صابون یا پودر پاک کننده آغشته نمایید.

3. هر دو روی لام را با مالیدن انگشتان آغشته به ماده ی پاک کننده تمیز کنید.

4. لام را با آب گرم بشویید.

5. در لام های بسیار کثیف مراحل 3 و 4 را چند بار تکرار نمایید.

6- چند قطره الکل روی لام بریزید و قبل از خشک شدن الکل، به کمک دستمال کاغذی تمیز آن را پاک نمایید.

اکنون لام جهت رنگ آمیزی باکتری ها آماده است. لذا مراحل زیر را برای قرار دادن و چسبانیدن باکتری ها روی لام جهت رنگ آمیزی انجام می دهیم:

1- تهیه گسترش

لامی که برای این منظور بکار می گیرید باید خشک، تمیز و عاری از چربی باشد. برای تهیه ی گسترش از محیط کشت مایع با حلقه ی فیلدوپلاتین یا پی پت پاستور یا سوآب، کمی از مایع مورد آزمایش را برداشته در وسط لام قرار دهید سپس آن را همچون ورقه نازکی روی لام گسترش دهید. هنگامی که از محیط کشت جامد گسترش تهیه می نمایید ابتدا باید یک قطره سرم فیزیولوژی را روی لام قرار دهید سپس با فیل دوپلاتین مقداری از پرگنه را برداشت نموده و در قطره ی روی لام حل کنید تا شیررابه ی یکنواختی تهیه بعد آن را در وسط لام پخش نمایید.

برای تهیه گسترش باید مقدار مناسبی از باکتری را روی لام قرار داد چرا که اگر گسترش خیلی ضخیم باشد به معنی آن است که مقدار زیادی از باکتری روی لام قرار گرفته و می تواند مانع عبور نور شود. همچنین در گسترش ضخیم باکتری ها اغلب روی همدیگر قرار دارند و مشاهده ی تک تک آنها مشکل است. گسترش ضخیم به طور معمول توسط مبتدیان و از کشت های جامد تهیه می گردد.

نقطه مقابل این مشکل تهیه ی گسترش خیلی نازک است یعنی تعداد بسیار کمی باکتری روی لام قرار می گیرد و در نتیجه پیدا کردن آنها با میکروسکوپ مشکل است. اینگونه گسترش ها بیشتر از محیط کشت های مایع تهیه می گردند. بنابراین گسترشی مطلوب و مناسب است که نه ضخیم و نه خیلی نازک باشد.

2- خشک کردن

چون بر اثر رنگ آمیزی و شستشوی مکرر ممکن است میکروب ها از روی لام کنده شوند لازم است گسترش را ثابت نمایید. یعنی به طریقی میکروب ها را کشته و روی لام بچسبانید. ثابت کردن را می توان به روش های مختلف انجام داد (مانند حرارت، الکل و...) ساده ترین روش حرارت دادن است. بدین منظور لام را تا پنج بار به طور آهسته از روی شعله چراغ عبور دهید باید دقت نمایید تا حرارت زیاد نباشد چون ممکن است میکروب ها سوخته و غیر قابل تشخیص گردند. اگر حرارت کم باشد ممکن است میکروب ها ثابت نشوند. برای در نظر گرفتن حرارت مناسب که در حدود 70 درجه است لام را با پشت دست امتحان کنید نباید سوزاننده باشد.

اگر بخواهید با الکل گسترش را ثابت کنید باید روی گسترش الکل ریخته و اضافه آن را خالی نمایید و صبر کنید تا بقایای الکل تبخیر شود. این عمل لا استفاده از شعله ور ساخت الکل نیز این عمل امکان پذیر است، در این روش روی گسترش چند قطره الکل ریخته و اضافه ی آن را خالی نمایید. لام را روی شعله بگیرید اما قبل از اینکه شعله الکل خاموش شود برای جلوگیری از تغییر شکل باکتری ها، شعله را خاموش نمایید. به طور کلی ثابت کردن باعث انعقاد پروتئین های باکتری ها و سلول ها می گردد و در اثر آن میکروب ها روی لام چسبیده و با شستن پاک نمی شوند.

رنگ آمیزی باکتری ها

برای مشاهده ی بهتر و آسان تر باکتری ها، آنها را رنگ آمیزی می نمایند. چرا که باکتری های رنگ نشده در زیر میکروسکوپ شفاف و بی رنگ هستند. بنابراین برای مشاهدات میکروسکوپی اغلب از رنگ آمیزی باکتری ها استفاده می شود. علاوه بر مشاهده ی آسان تر، رنگ ها می توانند جهت جداسازی و شناسایی باکتری ها نیز بکار روند که این موضوع در آزمایشات بعدی بیشتر مورد بررسی قرار خواهد گرفت.

رنگ های مورد استفاده در رنگ آمیزی باکتری ها اکثراً از موادی که در قطران زغال سنگ موجودی است ساخته می شود و چون در سابق رنگ های تولیدی از مشتقات آنیلین بودند به نام رنگ های آیلیک معروف شدند اما امروزه از مشتقات آنیلین کمتر استفاده می شود و رنگ های زغال سنگی جای آنها را گرفته است. این رنگ ها به دو گروه اسیدی و قلیایی تقسیم می شوند رنگ های اسیدی مانند فوشین اسیدی و ائوزین (به طور معمول برای رنگ آمیزی زمینه به کار می روند تا باکتری ها) نسبت به بعضی از بخش های بازی باکتری (مثل اجزای سیتوپلاسمی) میل ترکیبی دارند و رنگ های بازی همچون کریستال ویوله، آبی متیلن و سافرانین نسبت به بخش های اسیدی تمایل شدیدی دارند. سلول باکتری ها به طور کلی دارای خصوصیت اسیدی و دارای بار منفی است که علت آن وجود اسیدهای ریبونوکلئیک فراوان در سیتوپلاسم است. لذا با رنگ های قلیایی که دارای بار مثبت هستند ترکیب شده و رنگ می گیرند.

رنگ های بازی را در تجارت به صورت نمک می سازند. برای مثال آبی متیلن در واقع همان کلرید آبی متیلن است که با افزودن آب یونیزه شده و آبی متیلن با بار مثبت (کاتیون) بوجود می آید. طبق قانون بارهای الکتریکی مخالف یکدیگر را جذب می نمایند. بنابراین متیلن بلو با بار مثبت جذب باکتری که بار منفی دارد می شود.

                    (کلراید) +  (آبی متیلن) → (کلرور آبی متیلن)

در ضمن عوامل فیزیکی نیز در خاصیت رنگ پذیری باکتری ها مؤثر است به طور مثال فشار اسمزی و خاصیت چسبندگی در غلظت های بالا و به دام افتادن مولکول های رنگ در حفره های پلی مری و ماکروموکول ها، از جمله عوامل فیزیکی هستند.

به روش های زیر می توان میکروب ها رنگ آمیزی نمود:

الف) رنگ آمیزی ساده:

در این روش فقط از یک محلول برای رنگ آمیزی باکتری ها استفاده می شود و بدین وسیله می توان به شکل میکروب ها پی برد. در رنگ آمیزی ساده کلیه میکروب ها و سلول های موجود در گسترش به یک رنگ دیده خواهند شد. (مانند: رنگ آمیزی با آبی متیلن یا فوشین)

ب) رنگ آمیزی مرکب:

در این روش از چند محلول رنگی برای رنگ آمیزی باکتری و قسمت های مختلف آنها استفاده می شود.

ج) رنگ آمیزی منفی:

در این روش از رنگ هایی مانند نیگروسین و مرکب چین استفاده می شود. به علت اینکه این رنگ ها نمی توانند به داخل باکتری نفوذ نمایند، باکتری ها بی رنگ و زمینه ی لام، سیاه و تیره مشاهده می شود.

د) رنگ آمیزی افتراقی (انتخابی):

نوعی رنگ آمیزی است که باکتری های مختلف در برابر آن واکنش متفاوت نشان می دهند و از این جهت می توان آنها را برای تشخیص باکتری ها یا قسمت های مختلف باکتری بکار برد.

موضوع آزمایش: مشاهده کپک نان

هدف آزمايش:بررسي ومشاهده ساختمان كپك نان

وسايل آزمايش:

1.تكه نان

2.قطره چكان

3.لام ولامل

4.ميكروسكوپ

شرح آزمایش:

مرحله اول- با قطره چکان چند قطره آب روی سطح تکه نانی بریزید. سپس آنرا را داخل یک ظرف پتری قرار داده، در آن را بگذارید و چند روز در جای گرم و تاریکی قرار دهید.

پس از گذشت این مدت بر سطح نان چه می بینید؟ رشته های سبز رنگ کپک نان.

مرحله دوم- لام تمیزی انتخاب کنید و قطره ای آب در وسط آن قرار دهید. یکی از رشته های کپکی نان را توسط انبرک تشریح جدا کرده، دو قره آب وسط آب بگذارید و روی آنرا توسط لاملی بپوشانید. نمونه را در زیر میکروسکوپ با درشت نمایی های مختلف بررسی کنید.

آیا هاگ و هاگدانها را مشاهده می کنید؟ بله

پرسش و پاسخ:

1-برای رویش کپک چرا نان را مرطوب می کنید؟ زیرا این قارچ در محیط های مرطوب رشد می کند.

2-هاگدان ها در کجا قرار دارند و چگونه اند؟ هاگدان ها در انتهای پایه هایی قرار دارند که از ریشه قارچ منشعب می گردند.

براي ديدن تصاوير لطفا روي آنها كليك كنيد

عنوان آزمايش : كشـت باكتري و بررســـي ئيـدروليــــــز نشـــاسـتــــــه

هدف آزمايش : كشـت باكتري هــاي خــــاك و بررسي ئيـدروليــــــز نشـــاسـتــــــه تـوســـــط ميكروارگانيزم هـــاي موجـــود در خــاك

وسايل آزمايش :

1.پتري استرل 2.محلول نشاسته 2% همراه با آگار

3. 1 گرم خاك خشك

4.محلول يـد( لوگول)

5.سوآپ

روش تهيه محيط كشت جامد :

براي تهيه محيط كشت بايد مقدار معيني از آگار را با آب مقطر مخلوط كرد و براي مدتي در بَن ماري (حمام آب جوش ) قرار داده تا كاملاً حل شود سپس آنرا در پتري هاي استريل ريخته و پس از بسته شدن (جامد شدن ) مي توان انواع ميكروبها را روي آن كشت داد.

آگار يك پلي ساكاريد (گالاكتان ) است كه از نوعي جلبك دريائي به نام ردوفيتا بدست مي آيد

تذكر :

تمامي مراحل انجام كار بايد در محيط استريل و بدون وجود ميكروارگانيسم هاي محيط انجام پذيرد بدين منظور عمل كشت دادن باكتريها بايد در كنار شعله چراغ گاز انجام گيرد و از ظروف و وسايل تميز و استريل بايد استفاده كرد. چرا؟

 به علت اينكه فضاي اطراف چراغ گاز تقريباً استريل است اگر مراحل كشت در كنار چراغ انجام پذيرد ازورود ميكروبهاي ناخواسته به محيط كشت جلوگيري مي كنيم و با اين روش مي توانيم آزمايش خود را به نحو دلخواه كنترل كنيم و فقط ميكروبهاي خاك را مورد ارزيابي قرار دهيم .

شرح آزمايش:

يك گرم خاك خشك را در 15 ميلي ليتر آب مقطر حل كرده سپس سوآپ را به خاك آغشته كنيد و روي محيط كشت بكشيد .                                                                      

طريقه كشيدن سوآپ بر روي محيط كشت

مانند شكل زير مي توان در چند جهت مختلف سوآپ را بر روي محيط كشت به صورت زيكزاك كشيد .                                                         

محيط كشت بدست آمده را به مدت 3 روز در دماي 30 درجه قرار دهيد ( كنار بخاري آزمايشگاه ) . بعد از اين مـدت باكتري هاي كشت داده شده مانند شكل زير در داخل پتري ديده مي شوند. 

سپس محلول يد ( لگل ) را بر سطح ظرف پتري بريزيد . به طوري كه سطح آن را به طور كامل تا عمق يك ميلي متر بپوشاند . بعد از خالي كردن ميزان اضافي  يد از درون ظرف پتري نتيجه عمل را دراسلايد زير مشاهده مي كنيــد

نتيجه مشاهدات بر پايه دانسته ها:

مي دانيم نشاسته پلي مري از گلوكز است پس در اثر ئيدروليز اسيدي نشاسته , مالتوز (دو ملكول گلوكز ) و مقدار جزئي قند دكسترين ايجاد مي شود. از طرف ديگر مي دانيم كه آميلاز آنزيمي است كه در بزاق انسان و در بدن اغلب ميكروارگانيسمها وجود دارد. در آزمايش فوق نيز پس از كشت باكتريهاي خاك، در بدن اين باكتريها مقدار قابل توجهي آنزيم آميلاز وجود دارد, كه اين آنزيمها روي نشاسته موجود در محيط كشت اثر كرده و آن را به مالتوز مي شكنند

عنوان آزمايش: اثرصابون در جلوگيري از انتشار ميكروب ها

هدف آزمايش: بررسي ومشاهده اثرصابون در جلوگيري از انتشار ميكروب ها

وسايل آزمايش:

1.صابون

2.محيط كشت آماده

3.آب

شرح آزمايش:

ابتدا دوظرف (پتري)محيط كشت آماده تهيه كنيد بعد دستتان را بدون شست وشو وارد يكي ازمحيط هاي كشت كنيد سپس دستتان را با آب وصابون شسته ووارد محيط كشت آن ديگر ي بكنيد.محيط كشت را بمدت دو روز در يك محيط مناسب از نظر دما ونور قرار داده وسپس مقايسه كنيد.

اگر دقت لازم صورت گيرد در محيط كشت الف كلني از باكتري ها تشكيل مي شود در حالي كه درمحيط كشت ب كلني از باكتري ها تشكيل نمي شود.