رنگ آمیزی اسید - فست

پل ارلیش رنگ آمیزی اسید – فست را در سال 1882، به هنگام بررسی عامل بیماری سل (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس) ابداع کرد. برخی از باکتری ها وقتی با کربول فوشین غلیظ همراه با حرارت رنگ آمیزی شوند و بعد برای رنگ بری در تأثیر اسیدهای قوی قرار گیرند رنگ خود را از دست نمی دهند و در برابر اسیدها مقاومند (اسید – فست هستند). این پدیده اساس رنگ آمیزی اسید – فاست است که برای رنگ آمیزی باکتری های خانواده مایکوباکتریوم ها از جمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بکار می رود. در این روش ابتدا گسترش را تحت تأثیر کربول فوشین غلیظ و حرارت قرار می دهند سپس با اسید رنگ بری را انجام می دهند و پس از شستشو، لام را آبی متیلن رنگ آمیزی می نمایند. در این صورت کلیه باکتری ها به رنگ آبی در می آیند. به استثناء مایکوباکتریوم ها که اسید – فست بوده و رنگ قرمز مربوط به کربول فوشین را حفظ می کند. مقاومت در برابر در باکتری ها مربوط به وجود مواد چربی و موم موجود در دیواره است.

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس نه تنها در مقابل است بلکه در مقابل الکل هم، مقاوم است. زمانی که در نمونه های آزمایشگی (خلط و ادرار) رنگ آمیزی را انجام می دهیم باید لام ها را با اسید و الکل رنگ بری کنیم چرا که با این مایکوباکتریوم های ساپروفیت (همچون مایکوباکتریوم سمگماتیس) که در مقابل الکل مقاوم نیستند باعث اشتباه نشوند.

روش آزمایش (ذیل نلسون)

1. با رعایت شرایط سترون، گسترشی مخلوط ار کایکوباکتریوم اسمگماتیس و استافیلوکوس اپیدرمیدیس تهیه نموده، پس از خشک شدن با حرارت آن را ثابت نمایید.

2. گسترش را با کربول فوشین بپوشانید و به مدت 5 دقیقه روی حمام آب جوش،حرارت دهید.

3. ابتدا رنگ را از روی لام دور ریخته با آب شستشو دهید و با اسید سولفوریک 5 درصد رنگ بری نمایید.

4. لام را با آب شسته و با آبی متیلن به مدت 30 ثانیه گسترش را بپوشانید.

5. لام را دوباره با آب بشویید.

6. لام را به آرامی و به دقت با کاغذ خشک کن خشک کنید و یا به صورت مورب قرار داده و صبر کنید تا خشک شود.

7. با عدسی 100 میکروسکوپ و روغن ایمرسیون مشاهده نمایید.

* باکتری های اسید – فست قرمز رنگ و سایر باتری ها به رنگ آبی مشاهده می شوند.

* این رنگ آمیزی برای شناسایی و بررسی بیماری هایی که توسط باکتری های اسید – فست همچون بیماری سل (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس) و بیماری جذام (مایکوباکتریوم لپره) ایجاد می شوند، مورد اتژستفاده قرار م گیرند.

* برخی از گونه های جنس نوکاردیا اسید – فست نسبی هستند.

* اسپور باکتری ها در رنگ آمیزی اسید – فست به رنگ قرمز مشاهده می شود.

ادامه از پست قبلی

الف) روش آزمایش (روش شافر – فولتون)

1. از باسیلوس سوبیتیلیس گسترش تهیه نمایید و پس از خشک شدن با حرارت ثابت کنید.

2. گسترش را با سبز مالاشیت بپوشانید و به مدت 5 دقیقه روی حرارت حمام آب جوش قرار دهید.

3. مراقب باشید تا رنگ نجوشد و خشک نشود. برای جلوگیری از خشک شدن می توانید دوباره مقداری از سبز مالاشیت را روی لام اضافه نمایید.

4. رنگ را از روی لام خالی نمایید و با آب آن را بشویید.

5. با سافرانین به مدت 20 تا 30 ثانیه گسترش را بپوشانید.

6. رنگ را خالی نموده و با آب لام را بشویید.

7. با کاغذ خشک کن لام را خشک نمایید و با روغن ایمرسیون و عدسی 100 میکروسکوپ مشاهده کنید.

ب) روش آزمایش (روش دونر)

1. پنج قطره آب مقطر سترون را درون لوله ی آزمایش بریزید و با کمک فیلدوپلاتین پرگنه باسیلوس سوبتیلیس را به درون لوله انتقال داده و سوسپانسیون غلیظی از آن تهیه نمایید.

2. پنج قطره از کربول فوشین را به سوسپانسیون داخل لوله اضافه نمایید.

3. لوله ی آزمایش را به مدت 10 دقیقه درون آب جوش قرار دهید.

4. قطره کوچکی از نگروزین را روی لام قرار داده و چند لوپ از سوسپانسیون فوق را در آن حل نمایید.

5. با استفاده از انتهای یک لام قطره مذکور را روی لام پخش کنید.

6. صبر کنید تا گسترش به دست آمده در حرارت آزمایشگاه خشک شود.

7. زیر میکروسکوپ با عدسی 100 مشاهده نموده و مشاهدات خود را در گزارش کارتان ترسیم کنید.

* در این روش زمینه ی لام سیاه رنگ، اسپور قرمز رنگ و باکتری بی رنگ است.

ج) روش آزمایش

1. ار بسیلوس سوبتیلیس گسترش تهیه نموده و پس از خشک شدن، آن را با حرارت ثابت کنید.

2. با کربول فوشین گسترش را بپوشانید را بپوشانید و به مدت 5 دقیقه با شعله ی گاز حرارت دهید. دقت نمایید تا رنگ نجوشد و خشک نشود.

3. لام را با آب بشویید.

4. با آبی متیلن به مدت 30 ثانیه گسترش را رنگ آمیزی نمایید.

5. لام را با آب بشویید و پس از خشک شدن با عدسی 100 میکروسکوپ مشاهده کنید.

* اسپور به رنگ قرمز و باکتری به رنگ آبی مشاهده می شود.

رنگ آمیزی اسپور

برخی از باکتری ها دارای قدرت ایجاد اسپور هستند یا اندواسیور مرحله ی استراحت مقاوم در باکتری ها است. اسپورها قادرند در شرایط نامساعد که باکتری ها قادر به تحمل آن نیستند، مانند: حرارت، سرما، خشکی، مواد شیمیایی، تشعشعات و... زنده بمانند. هر باکتری فقط یک اسپور می سازد و از هر اسپور یک باکتری بوجود می آید.

اسپور ممکن است کروی یا بیضی باشد. اندازه ی آن بین 2/0 تا 2 میکرون است. در برخی از موارد قطر اسپور از قطر باکتری بزرگتر است و باعث برجستگی در باکتری می شود. گاهی نیز اسپور برابر یا کوچکتر از باکتری است. اسپور را به علت شفافیت و شکست زیاد نور می توان با میکروسکوپ فازکنتراست مشاهده کرد. اگر باکتری ها را به روش گرم رنگ آمیزی کنید اسپور را به صورت منطقه ای شفاف مشاهده می کنید. از جمله باکتری هایی که دارای اندواسپور هستند می توان جنس هاس کلستریدوم و باسیلوی، اسپوروسارسینا، اسپورولاکتوبا سیلوس، دسولفوتوماکولوک، کوکسیلا بورنتی (ریکتزیای عامل تب کیو) را نام برد.

بوسیله میکروسکوپ الکترونی در مقطع اسپور از داخل به خارج قسمت های زیر مشاهده می شود:

1. کور یا هسته اسپور: از پروتوپلاست تشکیل شده که حاوی یک هسته کامل (کروموزوم) است. آنزیم های تنفسی سیتوکرم در اسپور وجود ندارد و معدودی از آنزیم های سلولی که در شکل رویشی باکتری وجود دارند در اسپور به مقدار زیاد وجود دارند (مانند آلانین – راسماز) اما آنزیم دی پیکولینیک اسید سنتتاز تنها در اسپور وجود دارد. بخشی از توانایی مقاومت اسپور در مقابل حرارت مربوط بحالت نسبتاً خشک و کم آب آن است و دیگر وجود مقادیر بسیار زیادی پیکولینات کلسیم است که در شکل رویشی باکتری وجود ندارد.

2. غشا داخلی: از غشاء سیتوپلاسمی باکتری منشاء می گیرد.

3. دیواره ی اسپور: مانند دیواره باکتری ها است که هنگام جوانه زدن منشاء دیواره سلولی باکتری خواهد بود.

4. کورتکس: جنس آن از نوعی پپتیدوگلیکان است که ضخیم ترین لایه اسپور را تشکیل می دهد.

5. غشاء خارجی: مانند غشاء داخلی است.

6. پوشش اسپور: از ماده پروتئینی شبیه کراتین ساخته شده است.

7. اگزواسپوریم: در برخی از گونه ها وجود دارد. غشاء ظریفی است که از لیپوپروتئین تشکیل شده است.

اسپور را می توان به آسانی رنگ نمود و زمانی را پذیرفت به آسانی نمی توان رنگ زدایی کرد. بدین منظور برای نفوذ رنگ (سبز مالاشیت) به داخل پوشش اسپور از حرارت استفاده می شود. سبز مالاشیت به آسانی از جسم باکتری شسته می شود چرا که دیواره سلولی بر اثر حرارت آسیب دیده و پاره شده است. بدین سان اسپور دارای رنگ سبز مالاشیت و باکتری بدون رنگ است که می توان با رنگ دوم (سافرانین) آن را رنگ آمیزی نمود. در مشاهده ی میکروسکوپی لام رنگ آمیزی شده، اسپورها درون باکتری های سرخ رنگ به صورت منطقه های کروی یا بیضوی کوچک سبز رنگ دیده می شوند. البته اندازه، شکل و محل اسپور در داخل باکتری برای تشخیص ارگانیسم ها اهمیت دارد. برای مثال اسپورها می توانند در مرکز، انتها و یا نزدیک به انتهای باکتری جای داشته باشند.

رنگ آمیزی دیواره ی سلولی

دیواره ی سلولی پروتوپلاست را احاطه کرده و در قسمت خارجی غشاء سیتوپلاسمی قرار دارد با استحکام خود، مانع از پاره شدن غشاء سیتوپلاسمی و متلاشی شدن باکتری در فشارهای اسمزی می شود. فشار اسمزی در باکتری های گرم مثبت و گرم منفی به ترتیب ممکن است به حدود 25 و 10 اتمسفر برسد. دیواره سلولی حدود 15-10 درصد وزن خشک باکتری را تشکیل می دهد. به علت اینکه ساختمان شیمیایی جدار باکتری ها به هیچ یک از ساختمان های بافت های حیوانی شبیه نیستند برخی از آنتی بیوتیک ها همچون باسیتراسین، سفالوسپورین ها، ریستوستین، سیکلوسرین، پنی سیلین و وانکومایسین که بر سنتز دیواره سلولی تأثیر می گذارند باکتری ها را نابود می کنند بدون آنکه به میزبان آسیب برسانند.

در صورتی که باکتری ها در محلول های نمکی هیپرتونیک قرار داده شوند پرتوپلاست چروکیده شده خارج می شود و تنها دیواره سلولی (میان تهی) که شکل باکتری را حفظ نموده باقی می ماند این اثر را پلاسمولیز می نامند که در باکتری های گرم منفی آسانتر اتفاق می افتد. اما باکتری ها در محلول هایپوتونیک در مقابل ورم کردن بیش از حد و ترکیدگی مقاومند و علت آن وجود دیواره سلولی است.

تمامی سلول های پروکاریوتی به استثنای مایکوپلاسماها و باکتری های نمک دوست (هالوفیل) ترکیب دیواره ای مشترکی به نام پپتیدوگلیکان یا مورئین دارند که موجب استحکام و حفظ شکل سلول می شود. برخی از باکتری ها در شرایطی دیواره سلولی خود را از دست داده و باعث بوجود آمدن اشکال L. form باکتری می شوند. دیواره سلولی باکتری های هالوباکتریاسه فاقد پپتیدوگلیکان است، این باکتری ها برای حفظ ساختمان خود به نیروهای الکتروستاتیک وابسته اند و در محلول هایی که غلظت نمکی آنها کم است متلاشی می شوند. مایکوپلاسماها نیز فاقد دیواره سلولی اند همچنین در برخی از باکتری های متانوژنیک و آرکی باکتریاها بجای اسید مورامیک دیواره سلولی، اسید تالوسامینورونیک مشاهده می شود.

دیواره سلولی در سلول های پروکاریوت بسیار پیچیده است. دیواره سلولی جایگاه بسیاری از شاخص های آنتی ژنیک است که باکتری ها را از یکدیگر تمایز می دهند. دیواره سلولی در باکتری های گرم منفی همراه با فعالیت اندوتوکسینی است.

روش آزمایش

1. گسترشی ضخیم از باسیلوس سوبتیلیس تهیه نمایید.

2. صبر کنید تا مقداری از آب گسترش کم شود اما خشک نشود.

3. در حالیکه گسترش هنوز رطوبت دارد و بدون ثابت کردن از محلول اسید فسفومولیبدیک روی گسترش بریزید تا همه جای آن پوشانده شود و به مدت 4 دقیقه آن را نگه دارید.

4. رنگ را از روی لام خالی نمایید.

5. در حالیکه گسترش هنوز رطوبت اسید را از دست نداده به مدت پنج دقیقه آن را با محلول رنگی سبز متیل بپوشانید.

6. به آرامی لام را بشویید به طوری که گسترش آسیب نبیند.

7. صبر کنید تا لام در هوای آزمایشگاه خشک شود.

8. با استفاده از عدسی 100 و روغن ایمرسیون در زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.

9. مشاهدات خود را با توضیحات لازم در گزارش کارتان مرقوم فرمایید.

* دیواره سلولی به رنگ سبز تیره یا آبی و سیتوپلاسم به رنگ سبز روشن است البته گاهی ممکن است سیتوپلاسم اصلاً رنگ نگیرد.

همكار بسيار عزيزي از بنده در خواست منابع مطالعاتي بيشتري در مورد آزمايشگاه كرده بودند من هم كتابهايي كه در مورد آزمايشگاه دارم ومطالعه كرده ام جهت استحضارسروران گرامي تقديم ميدارم:

1-    كتاب آزمايشگاه زيست شناسي جانوري از انتشارات دانشگاه پيام نور

2-    كتاب آزمايشگاه سيستماتيك گياهي1 از انتشارات دانشگاه پيام نور

3-    كتاب آزمايشگاه سيستماتيك گياهي2 از انتشارات دانشگاه پيام نور

4-    كتاب آزمايشگاه فيزيولوژي جانوري 1 از انتشارات دانشگاه پيام نور

5-    كتاب آزمايشگاه فيزيولوژي جانوري 2 از انتشارات دانشگاه پيام نور

6-    كتاب آزمايشگاه جانورشناسي1 از انتشارات دانشگاه پيام نور

7-    كتاب آزمايشگاه جانورشناسي2 از انتشارات دانشگاه پيام نور

8-    كتاب آزمايشگاه فيزيولوژي گياهي1 از انتشارات دانشگاه پيام نور

9-    كتاب آزمايشگاه فيزيولوژي گياهي2 از انتشارات دانشگاه پيام نور

10-كتاب آزمايشگاه تشريح ومورفولوژي گياهي از انتشارات دانشگاه پيام نور

11-كتاب گياه شناسي عملي از انتشارات دانشگاه پيام نور

12- كتاب آزمايشگاه زيست شناسي انگل ها از انتشارات دانشگاه پيام نور

13- كتاب روش هاي آزمايشگاهي در بافت شناسي دكتر ايرج پوستي

14- كتاب آزمايشگاه ميكروبيولوژي از انتشارات دانشگاه پيام نور

15- كتاب آزمايشگاه ميكروب شناسي بابك براتي

16- كتاب آزمايشگاه ميكروبيولوژي عملي ترجمه دكتر ناصر گلبانگ

17- كتاب آزمايشگاه بيوشيمي عملي از انتشارات دانشگاه پيام نور

18- كتاب فيزيولوژي عملي دكتر علي نقي نژاد انتشارات نص

19- كتاب فيزيولوژي عملي دكترحسين صادقي شجاع

20- روش هاي آزمايشگاهي در تشريح گياهي تاليف دكتر محمد رضا امير جاني نشر دانشگاه اراك

21-آزمايشگاه جانورشناسي وتشريح جانوران آزمايشگاهي تاليف دكتر علي نقي ميرمويدي نشر دانشگاه رازي

22- اطلس تشريح ومورولوژي گياهي (سلول وبافت)تاليف دكتر احمد مجد ودكتر ايرانبخش نشر دانشگاه آزاد اسلامي

23-آناتومي گياهي تاليف اكبر نكوئي و.... نشر جهاد داشگاهي واحد صنعتي اصفهان

24- اطلس رنگي تشريح مهره داران ترجمه دكتر جمشيد درويش نشر داشگاه فردوسي مشهد

25- راهنماي كار هاي آزمايشگاه زيست شناسي دوره تربيت معلم تاليف حسين دانشفرومحمدعلي شميم

26-آزمايشگاه زيست شناسي رشته صنايع غذايي فني وحرفه اي

27- كتاب آزمايشگاه مباني ژنتيك از انتشارات دانشگاه پيام نور

28- كتاب ژنتيك عملي فرشته سليماني

29- كتاب آزمايشگاه زيست شناسي سلولي از انتشارات دانشگاه پيام نور

30-كتاب فعاليت هاي لذت بخش زيست شناسي از حسين الوندي

31- كتاب پروژه هاي زيست شناسي از آمنه جمشيدي

32- كتاب اكولوژي عملي از انتشارات دانشگاه پيام نور

33- تشريح وكالبد شناسي حيوانات اهلي دكتر حسين حملي

34-كتاب جنين شناسي عملي از انتشارات دانشگاه پيام نور

35- كتاب موفقيت در زيست شناسي ترجمه شيرين محمدي يگانه

.

.

.

رنگ آمیزی گرم

این نوع رنگ آمیزیاولین بار توسط یک پزشک دانمارکی به نام هانس کریستین گراهام در سال 1884 ابداع گردید و یکی از مهمترین و مفیدترین رنگ آمیزی هایی است که در آزمایشگاه میکروب شناسی مورد استفاده قرار می گیرد چرا که باکتری ها را به دو دسته اصلی گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می کند. این دسته بندی در تشخیص و شناسایی باکتری ها بسیار مفید و کاربردی است. زیر اغلب با خصوصیات عمده دیگر باکتری ها نظیر حساسیت به آنتی بیوتیک ها و غیره همراه است. برخی از این خصوصیات به طور نمونه در ذیل ذکر شده است.

1.  باکتری های گرم مثبت به طور معمول نسبت به پنی سیلین و مواد رنگی ضد باکتریایی (بازدارنده رشد باکتری) حساس تر از باکتری های گرم منفی هستند.

2. باکتری های گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و نیز آنزیم لیزوزیم حساسترند.

3. باکتری های گرم مثبت به طور معمول اگزوتوکسین تولید می کنند، در حالی که گرم منفی ها دارای اندوتوکسن هستند.

4. گرم مثبت بودن خصوصیتی است که به آسانی از بین می رود. در حالیکه گرم منفی بودن هرگز از بین نمی روند.

در این رنگ آمیزی باکتری هایی را که بوسیله حرارت ثابت شده اند به صورت پیاپی با کریستال ویوله و محلول (ید و یدیدپتاسیم) رنگ آمیزی نمود سپس برای رنگ زدایی از الکل و استون استفاده می شود که پس از شستشو با آب با یک رنگ متضاد (سافرانین یا فوشین) رنگ آمیزی می نمایند. باکتری های گرم مثبت رنگ اولیه خود را از دست نمی دهند و در زیر میکروسکوپ به رنگ آبی تیره در می آیند اما باکتری های گرم منفی رنگ اولیه را از دست می دهند و رنگ قرمز سافرانین یا فوشین را به خود می گیرند مرحله مشکل در هنگام رنگ آمیزی گرم، بی رنگ کردن آن ایست. اگر بی رنگ کردن(الکل و استون) بیش از اندازه باشد، باکتری های گرم مثبت، بی رنگ  خواهند شد و به صورت گرم منفی ظاهر می شوند و اگر بی رنگ شدن کافی نباشد، با کتری های گرم منفی، بی رنگ نخواهند شد و گرم مثبت بنظر می رسند. بنابراین، مرحله بی رنگ شدن باید مناسب و دقیق باشد. در ضمن باید باکتری مورد آزمایش جوان(کشت 12 تا 18 ساعته) باشد چرا که بسیاری از با کتری های گرم مثبت در اثر پیری خصوصیت خود را از دست داده و به صورت گرم منفی ظاهر می شوند.

هنوز هیچ توصیف قابل قبول و همگانی در مورد چگونگی واکنش گرم وجود ندارد گر چه نظریه های متعددی ارائه شده است اما هیچ یک از آنها به طور کامل رضایت بخش نیست به هر حال نظریه ای که هم اکنون اعتبار بیشتری دارد مکانیزم رنگ آمیزی گرم را به علت رسوب رنگی کریستال ویوله و لوگل می داند که در غشاء یا دیواره باکتری قرار می گیرد. دیواره سلولی باکتری های گرم منفی دارای لیپید بوده که در اثر شستشو با استون یا الکل حل شده و منافذی در سطح دیواره باکتری ایجاد می کند.الکی و استون از این منافذ عبور کرده و رسوب رنگی ایجاد شده را از بین می برد. از طرف دیگر، دیواره سلول باکتری های گرم مثبت فاقد لیپید بوده و دارای ترکیب ساختمانی خاصی مرکب از موکوپپتید است. در باکتری های گرم مثبت، پلی ساکارید همراه با ماده رنگی و اسید تیکوئیک در ساختمان دیواره ان دیده می شوند.

روش آزمایش

1. آزمایش گسترشی از باکتری مورد نظر تهیه کنید و پس از خشک شدن با حرارت ثابت نمایید.

2. روی لام به اندازه کافی رنگ کریستال ویوله بریزید و بگذارید که رنگ به مدت یک دقیقه روی لام بماند.

3. گوشه ای از لام را که تمیز است بین انگشت نشانه و شست نگهدارید و رنگ را در ظرف رنگ آمیزی خالی کنید و ان را با آب بشوئید.

4. لام را دوباره روی میله ی رنگ آمیزی قرار دهید و روی آن به مقدار کافی لوگل (ید و یدیدپتاسیم) بریزید و بگذارید به مدت یک دقیقه روی لام بماند.

5. محلول لوگل را دور ریخته و عمل شستشو (رنگ بری) را با الکل و استون انجام دهید به طوری که آخرین قطراتی که از لام می ریزد، صورتی کم رنگ یا بی رنگ باشد.

6. لام را بلافاصله با آب بشویید. (برای متوقف شدن عمل رنگ بری)

7. لام را دوباره روی میله ی رنگ آمیزی قرار دهید و آن را با رنگ متضاد سافرانین بپوشانید و به مدت یک دقیقه صبر کنید.

8. رنگ روی لام را خالی کرده با آب شستشو دهید.

9. به آرامی لام رنگ آمیزی شده را روی کاغذ خشک کن قرار دهید ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.

* رنگ آمیزی فوق را برای باکتری های اشریشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، نایسریاسیکا و باسیلوس سوبتیلیس انجام دهید و نتایج را در گزارش کار خود قید نمایید.

* پس از پایان رنگ آمیزی و مشاهده با عدسی 100 میکروسکوپ کدامیک گرم مثبت (آبی یا بنفش) و کدامیک گرم منفی (قرمز رنگ) هستند؟

* تقریباً یک سوم کوکسی ها، نیمی از باسیل ها و تمام اسپیروکت ها گرم منفی هستند.

* برای حفظ نمودن ترتیب مراحل رنگ آمیزی گرم می توانید از کلمه کلاس (ک = کریستال ویوله، ل = لوگل، ا = الکل یا استون، س = سافرانین) استفاده نمایید.

* در صورتی که گسترش را بیش از اندازه حرارت دهید (در عمل ثابت کردن)، دی.اره ی یاخته ها پاره می شود بنابراین باکتری های گرم مثبت رنگ کریستال ویوله را از دست می دهند و رنگ سافرانین را جذب می کنند.

* جهت انجام صحیح آزمایش باید به طول زمان و کامل بودن شستشو بعد از کریستال ویوله و مقدار آب باقیانده روی گسترش به هنگام اضافه نمودن لوگل، دقت نمود.

* برخی مواقع در اثر عدم رعایت زمان های لازم در رنگ آمیزی، ارگانیسم ها رنگ اصلی خود را کسب نکرده باعث اشتباه می شوند. جهت تشخیص باکتری های گرم منفی از گرم مثبت می توانید به روش ذیل نیز عمل کنید:

1- یک قطر پتاس 3 درصد را روی لام قرار دهید.

2- با استفاده از فیلدوپلاتین پرگنه باکتری را در قطره مذکور حل نمایید و به آهستگی فیلدوپلاتین را از محلول خارج سازید.

* اگر مایع چسبنده بود و تا ارتفاع 5/0 – 2 سانتیمتر از سطح لام بلند شد باکتری گرم منفی است در غیر این صورت گرم مثبت است.

* پرگنه باکتری های گرم منفی در مواجهه با سوآب آغشته به L.analine4-intrianilideباعث زرد رنگ شدن سوآب می شوند اما پرگنه باکتری های گرم مثبت این گونه نیست.