رنگ آمیزی ساده

همانطور که ذکر شد در رنگ آمیزی ساده کلیه قسمت های باکتری یکسان رنگ آمیزی می شوند که برای مشاهده ی شکل و اندازه میکروب ها بکار می رود. در این نوع رنگ آمیزی از یک نوع رنگ استفاده می شود و آن هم اغلب از انواع رنگ های قلیایی است که منجر به رنگ شدن باکتری می گردد. رنگ باکتری با توجه به رنگ به کار رفته متفاوت است به طور مثال در صورتی که از رنگ آبی متیلن استفاده شود باکتری به رنگ آبی مشاهده خواهد شد و اگر از رنگ های فوشین و سافرانین استفاده شود باکتری به رنگ قرمز نمایان خواهد شد.

شایان ذکر است که در این نوع رنگ آمیزی، اسپور و دانه های چربی رنگ نخواهند شد و به صورت شفاف مشاهده خواهند شد. این امر به دلیل ساختمان سخت اسپور و ماهیت دانه های چربی است که نحوه ی رنگ آمیزی آنها در آزمایش بعدی توضیح داده خواهد شد.

روش آزمایش:

1. ابتدا به گسترش از باکتری های استافیلوکوکوس، اشرشیاکلی و باسیلوس سوبتیلیس روی سه لام مختلف تهیه نمایید.

2. پس از خشک شدن گسترش ها، آن را با حرارت ثابت نمایید.

3. گسترش ها را با محلول رنگی آبی متیلن به مدت یک دقیقه بپوشانید.

4. با آب شستشو دهید و صبر کنید تا لام خشک شود.

5. با عدسی 100 و روغن ایمرسیون مشاهده کنید.

توجه: در رنگ آمیزی فوق بجای محلول رنگی آبی متیلن می توانید از محلول های دیگری همچون سافرانین یا فوشین نیز استفاده نمایید.

رنگ آمیزی منفی

در این روش، از رنگی ساده که باکتری ها را رنگ ننموده و تن ها زمینه لام را رنگ می کند استفاده می شود. یعنی زیر میکروسکوپ زمینه ی لام رنگی و باکتری ها به صورت اجسامی شفاف در این زمینه، مشاهده می شوند. مزیت این روش نسبت به روش های دیگر این است که، شکل میکروب ها در اثر اضافه شدن رنگ ها تغییر نمی کند ضمن آن را که میکروارگانیسم های مورد مطالعه به اندازه طبیعی خود دیده می شوند. رنگ هایی که خاصیتی این گونه رنگ سیاه هستند و باعث تیره شدن زمینه ی لام می شوند و قرمز کنگو نیز باعث قرمز شدن زمینه می گردد که در اثر افزودن اسید می تواند به رنگ آبی نیز مشاهده شود.

الف- روش آزمایش (نیگروزین)

1. ابتدا قطره ی کوچکی از نگروزین را روی لام تمیز و خشک قرار دهید.

2. با فیلروپلاتین مقدار کمی از پرگنه استافیلوکوکوس را برداشت نموده و در قطره نگروزین حل نموده گسترش تهیه کنید.

3. صبر کنید تا گسترش خشک شود.

4. با عدسی 100 و روغن ایمرسیون مشاهده نموده و در گزارش کار خود ترسیم نمایید.

تذکر 1: آزمایش فوق را با پرگنه با سیلوس سوبتیلیس و کلبسیلا نیز انجام دهید.

تذکر 2: می توانید به جای نگروزین از مرکب چین استفاده نمایید.

تذکر 3: برای بررسی و مشاهده ی جرم های دندان می توانید با استفاده از یک خلال دندان، سطح و شکاف بین دندان ها را تراشیده و از رسوب به دست آمده و نگروزین، گسترش تهیه نمایید.

ب – روش آزمایش (قرمز کنگو یا روژ دو کنگو)

1. ابتدا قطره ای از قرمز کنگو را روی لام تمیز و خشک قرار دهید.

2. با فیلدوپلاتین مقدار کمی از پرگنه های باکتری های فوق را برداشت نموده در قطره ی قرمز کنگو حل نموده گسترش تهیه کنید.

3. صبر کنید تا گسترش خشک شود.

4. روی لام محلول 1٪ اسید کلریدریک در الکل بریزید سپس لام را سرازیر کنید و بدون اینکه لام را شستشو دهید صبر کنید تا لام خشک شود.

5. با عدسی 100 و روغن ایمرسیون مشاهده کنید و مشاهدات خود را در گزارش کارتان ترسیم نمایید.

مقدمات رنگ آمیزی

در این قسمت فقط درباره ی مراحل مقدماتی تهیه یک گسترش باکتریایی، قبل از شروع هر نوع رنگ آمیزی صحبت خواهیم نمود سپس در مورد نحوه ی رنگ آمیزی گسترش بحث خواهیم کرد. چون باکتری ها موجودات بسیار کوچکی هستند در تهیه گسترش باید دقت نمود تا لام های مورد استفاده خراش نداشته باشند و باید تمیز باشند. چرا که هنگام استفاده از لام های خراش دار یا کثیف، خراش ها و ذرات گرد و غبار می توانند با میکروارگانیسم ها اشتباه شوند. همچنین هنگام کا با لامی که تمیز نیست گسترش بخوبی پخش نمی شود. در صورتی که لام کثیف بود جهت تمیز کردن آن به روش زیر عمل نمایید:

1. در کنار دستشویی آزمایشگاه باید ظرف حاوی پودر یا مایع پاک کننده قرار دهید.

2. شیر آب گرم را باز نموده و دو انگشت سبابه و میانی خود را خیس نموده به صابون یا پودر پاک کننده آغشته نمایید.

3. هر دو روی لام را با مالیدن انگشتان آغشته به ماده ی پاک کننده تمیز کنید.

4. لام را با آب گرم بشویید.

5. در لام های بسیار کثیف مراحل 3 و 4 را چند بار تکرار نمایید.

6- چند قطره الکل روی لام بریزید و قبل از خشک شدن الکل، به کمک دستمال کاغذی تمیز آن را پاک نمایید.

اکنون لام جهت رنگ آمیزی باکتری ها آماده است. لذا مراحل زیر را برای قرار دادن و چسبانیدن باکتری ها روی لام جهت رنگ آمیزی انجام می دهیم:

1- تهیه گسترش

لامی که برای این منظور بکار می گیرید باید خشک، تمیز و عاری از چربی باشد. برای تهیه ی گسترش از محیط کشت مایع با حلقه ی فیلدوپلاتین یا پی پت پاستور یا سوآب، کمی از مایع مورد آزمایش را برداشته در وسط لام قرار دهید سپس آن را همچون ورقه نازکی روی لام گسترش دهید. هنگامی که از محیط کشت جامد گسترش تهیه می نمایید ابتدا باید یک قطره سرم فیزیولوژی را روی لام قرار دهید سپس با فیل دوپلاتین مقداری از پرگنه را برداشت نموده و در قطره ی روی لام حل کنید تا شیررابه ی یکنواختی تهیه بعد آن را در وسط لام پخش نمایید.

برای تهیه گسترش باید مقدار مناسبی از باکتری را روی لام قرار داد چرا که اگر گسترش خیلی ضخیم باشد به معنی آن است که مقدار زیادی از باکتری روی لام قرار گرفته و می تواند مانع عبور نور شود. همچنین در گسترش ضخیم باکتری ها اغلب روی همدیگر قرار دارند و مشاهده ی تک تک آنها مشکل است. گسترش ضخیم به طور معمول توسط مبتدیان و از کشت های جامد تهیه می گردد.

نقطه مقابل این مشکل تهیه ی گسترش خیلی نازک است یعنی تعداد بسیار کمی باکتری روی لام قرار می گیرد و در نتیجه پیدا کردن آنها با میکروسکوپ مشکل است. اینگونه گسترش ها بیشتر از محیط کشت های مایع تهیه می گردند. بنابراین گسترشی مطلوب و مناسب است که نه ضخیم و نه خیلی نازک باشد.

2- خشک کردن

چون بر اثر رنگ آمیزی و شستشوی مکرر ممکن است میکروب ها از روی لام کنده شوند لازم است گسترش را ثابت نمایید. یعنی به طریقی میکروب ها را کشته و روی لام بچسبانید. ثابت کردن را می توان به روش های مختلف انجام داد (مانند حرارت، الکل و...) ساده ترین روش حرارت دادن است. بدین منظور لام را تا پنج بار به طور آهسته از روی شعله چراغ عبور دهید باید دقت نمایید تا حرارت زیاد نباشد چون ممکن است میکروب ها سوخته و غیر قابل تشخیص گردند. اگر حرارت کم باشد ممکن است میکروب ها ثابت نشوند. برای در نظر گرفتن حرارت مناسب که در حدود 70 درجه است لام را با پشت دست امتحان کنید نباید سوزاننده باشد.

اگر بخواهید با الکل گسترش را ثابت کنید باید روی گسترش الکل ریخته و اضافه آن را خالی نمایید و صبر کنید تا بقایای الکل تبخیر شود. این عمل لا استفاده از شعله ور ساخت الکل نیز این عمل امکان پذیر است، در این روش روی گسترش چند قطره الکل ریخته و اضافه ی آن را خالی نمایید. لام را روی شعله بگیرید اما قبل از اینکه شعله الکل خاموش شود برای جلوگیری از تغییر شکل باکتری ها، شعله را خاموش نمایید. به طور کلی ثابت کردن باعث انعقاد پروتئین های باکتری ها و سلول ها می گردد و در اثر آن میکروب ها روی لام چسبیده و با شستن پاک نمی شوند.

رنگ آمیزی باکتری ها

برای مشاهده ی بهتر و آسان تر باکتری ها، آنها را رنگ آمیزی می نمایند. چرا که باکتری های رنگ نشده در زیر میکروسکوپ شفاف و بی رنگ هستند. بنابراین برای مشاهدات میکروسکوپی اغلب از رنگ آمیزی باکتری ها استفاده می شود. علاوه بر مشاهده ی آسان تر، رنگ ها می توانند جهت جداسازی و شناسایی باکتری ها نیز بکار روند که این موضوع در آزمایشات بعدی بیشتر مورد بررسی قرار خواهد گرفت.

رنگ های مورد استفاده در رنگ آمیزی باکتری ها اکثراً از موادی که در قطران زغال سنگ موجودی است ساخته می شود و چون در سابق رنگ های تولیدی از مشتقات آنیلین بودند به نام رنگ های آیلیک معروف شدند اما امروزه از مشتقات آنیلین کمتر استفاده می شود و رنگ های زغال سنگی جای آنها را گرفته است. این رنگ ها به دو گروه اسیدی و قلیایی تقسیم می شوند رنگ های اسیدی مانند فوشین اسیدی و ائوزین (به طور معمول برای رنگ آمیزی زمینه به کار می روند تا باکتری ها) نسبت به بعضی از بخش های بازی باکتری (مثل اجزای سیتوپلاسمی) میل ترکیبی دارند و رنگ های بازی همچون کریستال ویوله، آبی متیلن و سافرانین نسبت به بخش های اسیدی تمایل شدیدی دارند. سلول باکتری ها به طور کلی دارای خصوصیت اسیدی و دارای بار منفی است که علت آن وجود اسیدهای ریبونوکلئیک فراوان در سیتوپلاسم است. لذا با رنگ های قلیایی که دارای بار مثبت هستند ترکیب شده و رنگ می گیرند.

رنگ های بازی را در تجارت به صورت نمک می سازند. برای مثال آبی متیلن در واقع همان کلرید آبی متیلن است که با افزودن آب یونیزه شده و آبی متیلن با بار مثبت (کاتیون) بوجود می آید. طبق قانون بارهای الکتریکی مخالف یکدیگر را جذب می نمایند. بنابراین متیلن بلو با بار مثبت جذب باکتری که بار منفی دارد می شود.

                    (کلراید) +  (آبی متیلن) → (کلرور آبی متیلن)

در ضمن عوامل فیزیکی نیز در خاصیت رنگ پذیری باکتری ها مؤثر است به طور مثال فشار اسمزی و خاصیت چسبندگی در غلظت های بالا و به دام افتادن مولکول های رنگ در حفره های پلی مری و ماکروموکول ها، از جمله عوامل فیزیکی هستند.

به روش های زیر می توان میکروب ها رنگ آمیزی نمود:

الف) رنگ آمیزی ساده:

در این روش فقط از یک محلول برای رنگ آمیزی باکتری ها استفاده می شود و بدین وسیله می توان به شکل میکروب ها پی برد. در رنگ آمیزی ساده کلیه میکروب ها و سلول های موجود در گسترش به یک رنگ دیده خواهند شد. (مانند: رنگ آمیزی با آبی متیلن یا فوشین)

ب) رنگ آمیزی مرکب:

در این روش از چند محلول رنگی برای رنگ آمیزی باکتری و قسمت های مختلف آنها استفاده می شود.

ج) رنگ آمیزی منفی:

در این روش از رنگ هایی مانند نیگروسین و مرکب چین استفاده می شود. به علت اینکه این رنگ ها نمی توانند به داخل باکتری نفوذ نمایند، باکتری ها بی رنگ و زمینه ی لام، سیاه و تیره مشاهده می شود.

د) رنگ آمیزی افتراقی (انتخابی):

نوعی رنگ آمیزی است که باکتری های مختلف در برابر آن واکنش متفاوت نشان می دهند و از این جهت می توان آنها را برای تشخیص باکتری ها یا قسمت های مختلف باکتری بکار برد.